Podstawy fizjologii i odporności

Organizm pszczoły miodnej to niezwykle skomplikowany układ, którego funkcjonowanie jest możliwe dzięki ciągłym reakcjom chemicznym w wieloetapowych cyklach biochemicznych. Owe procesy są często skomplikowane i uzależnione od wielu czynników zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych. Badaniem oddziaływań między cząsteczkami podczas tych reakcji zajmuje się biochemia. Natomiast ich skutkiem, czyli wykonaniem określonej czynności przez komórki, tkanki, organy, a w rezultacie cały organizm w celu utrzymania homeostazy¹ zajmuje się fizjologia. W ostatnim dziesięcioleciu badania z zakresu biochemii i fizjologii pszczół zostały zintensyfikowane głównie w kierunku poznania mechanizmów odporności. We wcześniejszych rozdziałach w wielu miejscach charakteryzowałyśmy procesy biochemiczne i omawiałyśmy wybrane zagadnienia fizjologiczne. Dlatego w ostatniej części książki postaramy się omówić i wyjaśnić mechanizmy odporności pszczół.

Wpływ diety na fizjologię

Podstawą dobrostanu pszczół jest zbilansowana, pełnowartościowa dieta, składająca się z pyłku kwiatowego i nektaru. Zawartość białka w pyłku jest zależna od gatunku rośliny i wynosi średnio 25–45%. Ponadto jest wskaźnikiem wartości odżywczej i jakości pyłku. Najbardziej ubogie w białko są pyłki roślin iglastych i traw, a najbogatsze – zaczerniowatych (Melastomataceae) i psiankowatych (Solanaceae). Wartość odżywczą pyłku można ocenić jeszcze dokładniej na podstawie składu aminokwasowego, ponieważ jego jakość pokarmowa zmniejsza się, gdy zawartości niezbędnych aminokwasów są nieodpowiednie. Aby utrzymać prawidłowy metabolizm ciała, pszczoły potrzebują 10 aminokwasów, tj. treoniny, histydyny, lizyny, waliny, metioniny, argininy, izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny i tryptofanu. Oprócz białek, pszczoły przyswajają z pyłku lipidy, minerały i witaminy.

Odporność pszczół

Odporność pszczół dzieli się na dwa główne typy: odporność socjalną i indywidualną. Na odporność socjalną (rodzinną), składają się: odporność behawioralna (zachowania pszczół, np. czyszczenie komórek z martwego czerwiu) i sekrecyjna (właściwości produktów pszczelich: mleczka pszczelego, kitu, miodu, nektaru i pyłku). Natomiast odporność indywidualna (którą szerzej omawiamy w tym rozdziale) opiera się na zewnętrznych barierach obronnych (takich jak bariery anatomiczno-fizjologiczne układu pokarmowego, oddechowego i kutikuli, które omówiłyśmy w poprzednich rozdziałach) i wewnętrznych barierach ochronnych. Wewnętrzne bariery ochronne mają na poziomie indywidualnym dwa typy odporności: wrodzoną (nieswoistą, fizjologiczną) i nabytą (swoistą).

Odporność wrodzona

Wewnętrzne bariery obronne to mechanizmy odporności komórkowej (wytwarzanie specjalnych komórek żernych, które atakują patogeny – u człowieka to np. limfocyty T, a u pszczoły hemocyty²) oraz odporności humoralnej, polegającej na wyprodukowaniu białek zabezpieczających pszczołę przed atakiem i rozwojem patogenów. Do odporności komórkowej zaliczamy następujące procesy: fagocytozę, nodulację i inkapsulację. Natomiast na odporność humoralną składają się:

1. odporność biochemiczna złożona z systemu proteolitycznego, antyoksydacyjnego i biomarkerów;

2. białka odpornościowe działające głównie w hemolimfie (tj. lizozym, fenolooksydaza, lektyny) oraz w innych tkankach (tj. rojalizyna, melityna i ceratotoksyna). Antymikrobiologiczne peptydy (AMP) tj. apidecyna, abecyna, hymenoptecyna i defensyna, zaliczane są przez jednych badaczy do odporności humoralnej, a przez innych do odporności nabytej. Aby łatwiej było zrozumieć te złożone mechanizmy, omówimy je poniżej krok po kroku w bardzo uproszczony sposób.

Od wniknięcia patogenu do jego unieszkodliwienia

Po wniknięciu patogenu, czyli przełamaniu przez niego barier anatomiczno-fizjologicznych pszczoły, niezależnie od tego, czy jest to kutikula, przewód pokarmowy czy układ oddechowy, zaczyna on penetrować tkanki gospodarza i wydzielać enzymy niszczące komórki. Wówczas w organizmie uruchamiane są jednocześnie mechanizmy odporności komórkowej (przy użyciu hemocytów) i odporności biochemicznej (zaliczane do odporności humoralnej).

Odporność biochemiczna, jak wspomniałyśmy wcześniej, to współpracujące ze sobą systemy: antyoksydacyjny i proteolityczny, których aktywność wspomagana jest przez biomarkery (markery biochemiczne). Owe markery są wskaźnikami zdrowotności pszczół i zalicza się do nich fosfatazę alkaliczną (ALP), aminotransferazę asparaginianową (AST) i alaninową (ALT). Enzymy te są też oznaczane w krwi człowieka (zobaczcie swoje wyniki z morfologii i biochemii krwi) i innych zwierząt. Co ciekawe, u ssaków wzrost ich wartości świadczy o stanie zapalnym, natomiast u pszczół jest odwrotnie i ich obniżenie informuje o niekorzystnej sytuacji.

Zarówno w hemolimfie, jak i w innych tkankach pszczoły, są enzymy zaliczane do systemuproteolitycznego, które tną białka patogenu na małe kawałki. System proteolityczny złożony jest z proteaz asparaginowych (aspartylowych, kwaśnych), tiolowych (cysteinowych), serynowych (zasadowych) i metaloproteaz oraz ich inhibitorów. Pozostałości po cięciu patogenów oraz inne cząstki tych reakcji nazywane są toksycznymi metabolitami, oraz reaktywnymi formami tlenu (ROS). Aby pszczeli organizm mógł się ich pozbyć, uruchamia cały sztab różnych antyoksydantów działających jak zmiotki, formując ROS i toksyczne metabolity w kopce, które następnie są neutralizowane. Ponadto w odpowiedzi na patogen uruchamiane są mechanizmy odpowiedzi komórkowej i intruz jest otaczany przez hemocyty. Dochodzi do fagocytozy, czyli wchłonięcia patogenu przez taką komórkę, w wyniku czego powstaje fagosom. Łączy się on z lizosomem, tworząc fagolizosom, który uwalnia do wnętrza swej dużej struktury enzymy (tj. lizozym, fosfatazy i in.) rozkładające białka, lipidy i kwasy nukleinowe patogenu. Fagocytujące hemocyty są otaczane dodatkowymi warstwami hemocytów ziarnistych³ oraz melanin, a proces powstawania takiego guzka nazywany jest nodulacją. Jednocześnie uwalniane są z takich struktur hemokininy (białka o aktywności, zbliżonej do cytokin kręgowców; są też substancjami przekaźnikowymi ułatwiającymi komunikację między komórkami), które pobudzają hemocyty do kolejnych reakcji obronnych oraz ciało tłuszczowe do syntezy białek odpornościowych, tj. lizozymu, fenolooksydazy, lektyny, abecyny, apidecyny i in. Białka te są gotowe do działania dopiero po kilkunastu godzinach od zakażenia. Podczas ich syntezy i aktywacji uruchamiany jest szlak tyrozynowy (chinonowy), w wyniku którego produkowana jest sklerotyna i melanina (czytaliście o nich w rozdziale II). Sklerotyna uszczelnia pancerz pszczoły i zabezpiecza go przed wnikaniem kolejnych patogenów. Z kolei melaniny są ciemnymi barwnikami, potrzebnymi do obrony przed wnikającymi mikroorganizmami i pasożytami, niezbędnymi w gojeniu ran i pigmentacji naskórka. Uczestniczą także w tworzeniu guzków melanotycznych, czyli w inkapsulacji. Uwięziony w takich guzkach patogen jest cięty przez enzymy i odizolowany od hemolimfy. Wraz z prądem hemolimfy guzki przesuwane są w kierunku kutikuli, która ciemnieje wraz z procesami starzenia pszczoły i kolejnymi kontaktami owada z dużą ilością patogenów w ciągu jego życia. Dlatego starsze pszczoły są ciemniejsze (nie tylko przez utratę jasnych włosków).

» lektyny, nazywane również hemaglutyninami, są białkami wiążącymi patogeny do hemocytów (głównie plazmatocytów⁵) i tym samym aglutynują je (czyli wręcz sklejają), ułatwiając fagocytozę i inkapsulację.

W niektórych źródłach znajdziecie jeszcze trzy inne białka zaliczane do elementów odporności humoralnej, których miejscem działania są inne tkanki niż hemolimfa. Są to:

» rojalizyna , nazywana jest też w niektórych źródłach defensyną 1, chociaż niżej przeczytacie, że istnieje również inne białko o takiej nazwie. Wszystko dlatego, że zarówno rojalizyna, jak i defensyna 1 powstają z tego samego pleomorficznego genu o nazwie defensyna 1. Rojalizyna to 51-aminokwasowy polipeptyd, zaliczany do grupy defensyn owadów. Defensyny są białkami bogatymi w cysteinę. Mają antybakteryjne właściwości, są zaangażowane w przekazywanie sygnałów odpornościowych lub spełniają obie te funkcje. Masa cząsteczkowa rojalizyny wynosi 5,52 kDa. Rojalizyna jest głównie aktywna przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, a rzadziej przeciwko bakteriom Gram-ujemnym. Po zakażeniu, ekspresja rojalizyny jest indukowana w ciele tłuszczowym, skąd jest wydzielana do hemolimfy. Rojalizyna znajduje się także w gruczołach gardzielowych pszczoły (gdzie również jest produkowana) oraz żuwaczkowych i ślinowych. Rola tego peptydu w mechanizmach odporności polega na regulowaniu składu mikroflory jelitowej oraz konserwowaniu mleczka pszczelego.

» ceratotoksyna, 29-aminokwasowy peptyd, który jest silnie zasadowy i termostabilny (co oznacza, że jest stabilny w wysokich temperaturach). Cząsteczka ceratotoksyny zawiera sześć reszt lizyny. Białko to działa litycznie na bakterie Gram- dodatnie i ujemne. Jego rola w odporności polega na utrzymaniu sterylności układu rozrodczego matek w trakcie zaplemnienia oraz na ochronie jaj i młodych larw przed patogenami.

Jak wyżej wspomniałyśmy, pszczoły syntetyzują antymikrobiologiczne peptydy (AMP), które zaliczane są przez jednych badaczy do odporności humoralnej wrodzonej, a przez innych do odporności nabytej. Zalicza się do nich następujące białka:

» apidecyny (nazywane też apidaecynami lub apidycynami), 18-aminokwasowe polipeptydy o masie cząsteczkowej 2,1 kDa, które w hemolimfie czerwiu są w formie nieaktywnej, nazywanej proapidecynami. Forma aktywna pojawia się dopiero u dorosłych osobników po kontakcie z patogenami, głównie bakteriami Gram-ujemnymi. Proapidecyna, która charakteryzuje się większą liczbą reszt aminokwasowych niż forma aktywna, jest cięta przez aminopeptydazy, w wyniku czego powstaje apidecyna i biologicznie nieaktywny peptyd. Apidecyna ma trzy izoformy: Ia, Ib i II, które różnią się między sobą podstawnikami⁶ (tj. waliną, izoleucyną i leucyną) w łańcuchach w pozycjach szóstej i 18. Aktywność apidecyny jest hamowana przez trypsynę i chymotrypsynę⁷. Apidecyna ma silniejsze właściwości bakteriostatyczne niż bakteriobójcze (czyli raczej hamuje namnażanie i rozwój bakterii niż je zabija) i są na nią wrażliwe trzy grupy bakterii:

1. z rodziny Enterobacteriaceae (np. Salmonella typhimurium i Shigella flexneri), które żyją w przewodzie pokarmowym zwierząt i są przez nie wydalane z kałem, przez co zanieczyszczają wodę, glebę i rośliny, z którymi mają styczność zbieraczki;

2. fitopatogenne, czyli wywołujące choroby roślin, np. Pseudomonas syringae;

3. związanych symbiotycznie z roślinami wyższymi, np. Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium melliloti.

Zbieraczki mają najczęściej kontakt z mikroorganizmami z grupy drugiej i trzeciej. Bakterie te zostają przekazane pszczołom ulowym przez trofalaksję lub dotyk i gnieżdżą się u nich w przewodzie pokarmowym i na powłokach ciała.

» abecyny (nazywane też abaecynami), 34-aminokwasowe polipeptydy o masie cząsteczkowej 3,8 kDa. W cząsteczce znajduje się 10 reszt proliny i tylko jedna reszta tryptofanu, natomiast nie ma cysteiny. Abecyny reagują na bakterie Gram-dodatnie oraz na niektóre Gram-ujemne. Ich działanie jest słabsze w porównaniu z apidecynami, które ukierunkowane są na bakterie stanowiące stałe, potencjalne zagrożenie dla pszczół. Ponadto abecyny mają wąskie spektrum aktywności antybakteryjnej o opóźnionej efektywności, dlatego uważa się, że pełnią one rolę wspomagającą w odporności.

» hymenoptecyny (nazywane też hymenoptaecynami), 93-aminokwasowe polipeptydy, które zawierają kwas 2-pirolidono-5-karboksylowy na N-końcu łańcucha. Związek ten hamuje żywotność bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich w hemolimfie pszczoły.

» defensyny są reprezentowane przez dwa peptydy, defensynę 1 i defensynę 2 o masach cząsteczkowych odpowiednio 5,5 i 4,8 kDa. Kodowane są przez dwa geny: defensynę 1 (która koduje także rojalizynę, o czym pisałyśmy wyżej) i defensynę 2. Defensyna 2 jest wytwarzana w ciele tłuszczowym, przewodzie pokarmowym i komórkach hemolimfy. Defensyny są aktywne cytotoksycznie na bakterie Gram-dodatnie oraz niektóre Gram-ujemne, a także na grzyby (tj. Ascosphera apis, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Candida albicans i Aurobasidium ­pullulans).

Szlaki immunologiczne

Pszczoły są atakowane przez różne patogeny, dlatego muszą mieć co najmniej kilka szlaków immunologicznych, które umożliwią rozpoznanie zagrożenia. Do szlaków tych zalicza się:

» Jak/STAT (Janus kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription – kinazy janusowe⁸/Transduktor Sygnału i Aktywator Transkrypcji);

» Toll via NF-κB (Nuclear Factor κB/Dorsal – czynnik jądrowy κB/Dorsal);

» Imd (Immune deficiency – deficyt odpornościowy) poprzez NF-κB/Relish;

» iRNA (RNA interference – interferencja RNA);

» JNK (c-Jun N-terminal kinase);

» MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases – kinazy aktywowane mitogenami).

Szlaki te są wieloetapowe i skomplikowane, dlatego nie będziemy zanudzały Was ich opisami. Najważniejsze, abyście zapamiętali, że ich końcowym efektem są aktywności ww. białek odpornościowych.

Odporność nabyta

U pszczół wykształciły się także mechanizmy odporności nabytej (tzw. indukowanej), różniące się znacznie od tych ssaczych. U owadów nie powstają przeciwciała i brak jest pamięci immunologicznej, a białka o właściwościach antypatogennych utrzymują się w hemolimfie tylko przez trzy lub cztery dni. Warto w tym miejscu zaznaczyć, iż sprawnie funkcjonujące systemy odpornościowe są uzależnione od mian hormonu juwenilnego, stężeń ekdysteroidów i witelogeniny. Wpływ tych hormonów na tkanki pszczoły i ich korelacje oraz metabolizm przedstawiłyśmy w rozdziale XI, a o witelogeninie pisałyśmy w rozdziale X.

W badaniach dotyczących możliwości analizy hemolimfy pod kątem diagnozowania porażenia owadów Nosema ceranae (tak jak analizuje się naszą krew pod kątem wykrywania chorób) zbadano tę tkankę u pszczół zdrowych i wykryto w niej 65 metabolitów, z czego zidentyfikowano 33. Były to związki biorące udział w różnych ścieżkach metabolicznych, takich jak cykl Krebsa, metabolizm glicyny, seryny, alaniny, treoniny, a także cukrów (jak fruktoza czy mannoza), glikoliza i glukonogeneza, szlak pentozofosofranowy i rozkład waliny, leucyny i izoleucyny. Były też w niej kwasy tłuszczowe (np. linolowy), kwasy organiczne (np. mlekowy), aminokwasy (np. glicyna), cukrole (np. sorbitol).

1 - W tym przypadku mówimy o stanie równowagi organizmu osiąganym przez samoregulację.

2 - Hemocyty to komórki pełzakowate hemolimfy zdolne do fagocytozy, czyli wychwytywanie i pochłanianie przez komórkę mikroskopijnych ciał stałych.

3 - Za Urbański A., Czarniewska E., Baraniak E., Rosinski G. Morfologia i aktywność fizjologiczna oraz praktyczne wykorzystanie badań na hemocytach owadów „Postępy Biologii Komórki” 2013, nr 2, s. 295–306: Hemocyty ziarniste posiadają duże zdolności adhezyjne. Są to komórki, które jako pierwsze wchodzą w kontakt z ciałami obcymi (ang. non-self) i rozpoczynają proces enkapuslacji (zamykania przyp. redakcji) i nodulacji. Podczas kontaktu z ciałami obcymi komórki te uwalniają zawartość swoich granul. Większość autorów uważa, że egzocytoza składników ziarnistości „przywabia” plazmatocyty oraz wspomaga budowę kapsuł i tworzenie nodul.

4 - Za PWN: odrębny pod względem strukturalnym i funkcjonalnym obszar w komórce, oddzielony od innych błoną lipoproteinową.

5 - Komórki plazmatyczne (plazmocyty) są komórkami układu immunologicznego, których funkcją jest produkcja i wydzielanie przeciwciał u ssaków i enzymy u owadów.

6 - Przypominamy z chemii, że podstawnik w tym przypadku to inaczej grupa funkcyjna, która zmienia właściwości chemiczne związku organicznego i decyduje o sposobie jego reagowania w danej reakcji.

7 - I trypsyna i chymotrypsyna są enzymami.

8 - Nazwa tych kinaz nawiązuje do Janusa, rzymskiego boga o dwóch twarzach, gdyż kinazy JAK mają dwie domeny białkowe o odmiennym działaniu: jedna ma aktywność kinazową, a druga hamuje działanie pierwszej.

Zamów prenumeratę czasopisma "Pasieka"