Miodowy odcisk palca

Zdjęcie: Freepik

Co zrobić, by analizy pyłkowe były tańsze i szybsze? Już od jakiegoś czasu głowią się nad tym naukowcy z Zakładu Chemii i Toksykologii Żywności Instytutu Technologii Żywności i Żywienia Uniwersytetu Rzeszowskiego. Tym razem skupili się na aminokwasach i białkach.

Badania sfinansowano w ramach projektu „Związki azotowe jako nowe narzędzie weryfikacji odmiany i autentykacji pochodzenia miodu” (nr 702/2021) przez Krajowy Ośrodek Wsparcia Rolnictwa w ramach mechanizmu Wspólnej Polityki Rolnej „Wsparcie Rynku Produktów Pszczelich”. Analizy podjęli się naukowcy z Uniwersytetu Rzeszowskiego: dr hab. inż. Małgorzata Dżugan, prof. UR, dr inż. Michał Miłek, mgr inż. Ewelina Sidor.

Miód nie zawiera dużo białek, bo tylko ok. 1%, jednak są to związki o niskiej stabilności termicznej (czyli rozkładające się w wysokich temperaturach), więc mogą świadczyć o jakości produktu. W miodach prawidłowo przechowywanych białka (w tym enzymy dodane przez pszczoły) nie ulegają tak szybko rozpadowi i można na ich podstawie ocenić jakość patoki i jej skład gatunkowy. W miodzie znajdują się enzymy takie jak diastaza, inwertaza, oksydaza glukozowa, kwaśna fosfataza, a także wolne aminokwasy jak prolina (stanowi 50–80% wszystkich białek patoki – obecnie służy do wykrywania fałszowania tego produktu). W zależności od pochodzenia botanicznego, sposobu przechowywania i dekrystalizacji, stężenie białka w miodzie się zmienia. Sam profil aminokwasowy jest stosowany do botanicznej klasyfikacji miodów, np. arginina jest charakterystyczna dla miodu kasztanowego, a tryptofan dla akacjowego.

Czytaj także: Przychodzi pszczoła do lekarza

Naukowcy przebadali 90 próbek miodów ośmiu odmian kupionych na podkarpaciu (miody lokalne) i dostępnych w marketach mieszanek komercyjnych, importowanych. Analizy wykonane metodą Bradforda wykazały zawartość białka na poziomie 0,02–0,05 g/100 g. Wartości te różniły się w zależności od pochodzenia i odmiany patoki. Najwięcej białek miały miody ciemne. Natomiast komercyjne miały mniej aminokwasów niż lokalne.

Dzięki użyciu elektroforezy w warunkach denaturujących SDS–PAGE (ang. Sodium Dodecyl Sulfare – PolyAcrymide Gel Electrophoresis) frakcjonowano białka miodów i utworzono bazę wzorcowych profili dla każdej z badanych ośmiu odmian. Określanie rodzajów białek podczas elektroforezy polega na umieszczeniu zjonizowanych białek w żelu i podłączeniu całości do prądu. Białka zaczynają migrować, a odległość, jaką pokonają, zależy od ich wielkości, kształtu i ładunku elektrycznego. Później żel się barwi, dzięki czemu ułożenie białek w nośniku się ujawnia. Znając właściwości białek, miejsce w którym się kumulują itd., badacz może ocenić, z jakim związkiem ma do czynienia. Jeśli kiedykolwiek oglądałeś serial lub dokument kryminalny, w którym porównywano profile DNA[1] złoczyńców i osób podejrzanych, to na pewno kojarzysz charakterystyczne prążki, które układają się w różny sposób – to jest właśnie elektorforeza. Miejsca rozkładu białek w żelu są dla nich charakterystyczne, to tzw. odciski palców (ang. fingerprints). Jak widać, profilować za pomocą białek można nie tylko przestępców, ale również miody. W żelu pojawiają się zawsze prążki białek od pszczół, dodane podczas przerabiania nektaru przez owada, ale też różne paski białek roślinnych. Takie charakterystyczne układy można przetworzyć komputerowo i utworzyć na ich podstawie bazę danych wzorcowych profili białkowych miodu.

Zdjęcie: Freepik. Opis: Prążki DNA rozdzielone dzięki elektroforezie 

Jednak to nie jedyny sposób, jaki wykorzystali naukowcy do dokładnego określenia profilu białkowego danej odmiany miodu. Innym rodzajem badań był spektrofotometryczny pomiar aktywności enzymów. Oprócz diastazy przebadano rzadziej analizowane glikozydazy: α-glukozydazę, β-galaktozydazę, N-acetyloglukozaminidazę i α-mannozydazę. Jednak aktywność enzymów w obrębie danej odmiany niestety była zróżnicowana, co uniemożliwia wykorzystanie tego sposobu analizy do oceny gatunkowości miodu. Ciekawostką jest, że aktywność enzymów była tylko minimalnie wyższa w miodach lokalnych niż komercyjnych.

Kolejną metodą, którą przetestowano, by sprawdzić, czy nadaje się do klasyfikacji białkowej odmian miodu, była wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa HPTLC (ang. High Performance Thin Layer Chromatography). Ogólnie rzecz ujmując, jest to ulepszona metoda chromatografii cienkowarstwowej, a same metody chromatograficzne polegają na (według PWN) rozdzieleniu jednorodnych mieszanin na składniki, w której wykorzystuje się różnicę sił oddziaływania tych składników z fazą ruchomą i nieruchomą.

Czytaj także: Parafina w wosku

Do określania profilu białkowego miodu zastosowano tę metodę po raz pierwszy. Wszystkie odmiany miodów (co nie powinno być zaskoczeniem) zawierały prolinę, ale w różnych ilościach. W próbach wykryto inne aminokwasy, przede wszystkim izoleucynę (w miodzie gryczanym) lub kwas asparaginowy (w patoce ze spadzi liściastej), ale było ich niewiele. Naukowcy stwierdzili, że metoda HPTLC jest potencjalnie przydatna do oznaczania ilościowego proliny w miodzie i może być alternatywną metodą do oznaczania kolorymetrycznego[2].

W podsumowaniu naukowcy doszli do wniosku, że dzięki wzorcowym profilom białkowym (opisana metoda wykorzystująca elektroforezę i „prążki”) i metodom pomocniczym wymienionym w artykule, można potwierdzić, czy pszczelarz prawidłowo oznaczył odmianę miodu. Dzięki temu będzie można ograniczyć liczbę próbek wymagających potwierdzenia za pomocą analizy pyłkowej.

[1] Kwas deoksyrybonukleinowy też może być rozdzielany w taki sposób.

[2] Metoda kolorymetryczna według PWN: polega na oznaczaniu stężenia substancji na podstawie porównania barwy roztworu badanego i wzorcowego (kolorymetr).

Źródło: pzp.biz.pl